体外稳定同位素标记在植物小分子代谢物分析中

  【摘要】:电喷雾电离(ESI)是一种软电离技术,可在大气压下直接将有机分子从溶液中电离并转化为气态离子,而且这种电离并不破坏有机分子的结构。ESI的出现促进了液相色谱与质谱联用技术的发展。如今,液相色谱质谱已经在生物大分子、有机小分子及配合物的定性、定量分析中得到了广泛的应用。然而,对于部分弱极性的物质,ESI的离子化效率并不理想,在复杂的植物样品中,这些物质的离子化还受到基质中易电离物质的抑制。此外,在非目标性代谢物及内标无法获取的代谢物的分析中,电喷雾质谱(ESI-MS)的信号波动严重影响了定量的准确度与重现性。已有的体外稳定同位素标记技术克服了仪器信号波动的影响,实现了对蛋白及小分子代谢物的相对定量分析,但该方法需要在质谱分析前将轻重同位素标记的样品进行混合,这使样品变得更加复杂。本文试图通过使用新合成的稳定同位素标记试剂和新的质谱分析策略,解决植物小分子代谢物分析时遇到的难题,主要包括以下四部分的内容:

  含季铵盐基团的新型衍生化试剂的合成与评价以三甲胺、吡啶或喹啉取代1,3-二溴丙酮的一个溴原子,分别合成了溴代丙酮基三甲铵(BTA)、溴代丙酮基吡啶铵(BPA)及溴代丙酮基喹啉铵(BQA)。这三种含季铵基团的衍生化试剂,溴原子未被取代的α-羰基溴为三种试剂共同的反应活性片段。对反应活性进行了实验及理论研究,结果表明BTA、BPA及BQA的反应活性依次下降。反应选择性研究表明BQA是一种新型的巯基衍生化试剂,BPA对羧基化合物的选择性优于BTA。我们还分别优化了BQA与巯基化合物及BPA与羧基化合物衍生化反应的条件,在最优衍生化条件下评价了BQA及BPA分别对巯基及羧基化合物的衍生化效率,同时考察了衍生化前后ESI-MS灵敏度的变化。

  体外稳定同位素标记用于茉莉酸代谢路径中各代谢物的分析使用溴代丙酮基吡啶铵(BPA)及d5-溴代丙酮基吡啶铵(d5-BPA)作为同位素标记试剂,HPLC-QTOF-MS作为分析工具,对盐胁迫水稻及早衰型水稻突变体中茉莉酸代谢路径上的各代谢物进行了相对定量分析。使用新的数据分析方法对结果进行分析,分析结果表明茉莉酸代谢路径中多个代谢物在盐胁迫或早衰型突变体中发生了显著变化,部分物质相对于对照组表现出明显的累积。

  体外稳定同位素标记—双中性丢失扫描用于含羧基生物标志物的预筛选以羧基化合物为分析对象,设计合成了N,N-二甲基丁二胺及4d-N,N-二甲基丁二胺等衍生化试剂。这对试剂含有反应活性基团(氨基)、ESI易电离基团(叔胺)、同位素标记基团(甲基),其中含同位素标签的二甲基氨基片断在CID碰撞池中易作为中性片段丢失。将高效液相色谱与串联质谱联用,使用体外稳定同位素标记—双中性丢失扫描策略,对受伤蕃茄中潜在的含羧基的生物志物进行预筛选,所筛选出的生物标志物的结构使用高分辨质谱扫描和串联质谱的子离子扫描进一步确认。通过查阅代谢组学数据库及相关文献,对于筛选出的潜在酸性生物标志物进行了详细的功能分析。

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